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      2. 細胞傳代操作步驟



        一、   貼壁細胞傳代(以一個T25瓶為例)

        1、 吸出原培養液;

        2、 加入2ml左右PBS,輕輕晃動培養瓶潤洗細胞,吸出PBS丟棄;

        3、 加入1ml左右胰酶,輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有細胞,放入培養箱消化;

        4、 消化時間跟據細胞特性有所不同,顯微鏡下看到細胞塊中間的細胞明顯分離變圓,側立培養瓶細胞可以滑落時可終止消化,全程不要拍打培養瓶;

        5、 加入3ml含血清的培養基終止消化,吹打細胞使之脫落并在液體里反復吹打使細胞,使之盡量呈單顆細胞的懸浮液,這時可以在顯微鏡看下;

        6、 收集細胞懸液離心,1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完吸出上清丟棄。

        7、 加入新鮮培養基,吹打幾下混勻細胞即可,按需接種到新培養瓶,補足培養基,擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進行培養。

        8、 檢查培養箱二氧化碳,溫度和水盤。


         

        二、   懸浮細胞傳代(以一個T25瓶為例)

        1、 輕輕吹散懸浮細胞,部分貼壁松散的懸浮細胞可直接吹打培養瓶底部使細胞懸浮,收集細胞懸液到無菌離心管中,離心1200rpm(約250g) 3分鐘,離心完畢吸出上清丟棄;

        2、 加入適量新鮮培養基重懸細胞,按比例接種至培養瓶(接種比例按實際情況,不確定可計數后再接種);

        3、 常規細胞推薦以3~5×105cells/ml傳代,長到2×106cells/ml傳出;

        4、 建議剛開始幾代計數后傳代,后面可以根據經驗按比例傳代。

         

        三、     半貼壁半懸浮細胞傳代(以一個T25瓶為例)

        1、 培養液(含懸浮的細胞):用移液器吸出培養液轉移到無菌離心管中;

        2、 貼壁部分:用1ml PBS洗細胞,吸出PBS放入到第1步裝有培養液的離心管中收集(不要直接丟棄,里面有細胞);

        3、 培養瓶加入胰酶1ml,放入培養箱靜置消化;

        4、 消化時間跟據細胞特性有所不同,顯微鏡下看到細胞明顯收縮變圓,側立培養瓶細胞可以滑落時可終止消化,全程不要拍打培養瓶;

        5、 用3ml含血清的培養基終止消化,將消化下來的細胞懸液吹散細胞后收集到第1步的離心管;

        6、 將離心管在1200rpm(約250g) 3min離心,離心完畢棄掉上清,加入新的培養基重懸,按實際情況分瓶,放入培養箱培養。

         

        溫馨提示:

        1、 每丟棄一個液體前都要想一下里面有沒有可能有細胞,避免丟失細胞。

        2、 細胞種類、細胞密度、細胞狀態、甚至胰酶的品牌,均影響到細胞的消化時間,所以消化的時候不要只看時間,以顯微鏡下細胞的狀態來確定消化終點,部分難消化的細胞消化時間甚至可以長達15分鐘。

        3、 細胞的傳代比例通常說的是等體積的容器,不同容器需要換算;例如:一個T25培養瓶的細胞傳到一個10cm培養皿里面,雖然是1傳1,但是比例可不是1:1;T25瓶底面積25cm2,10cm培養皿底面積約為55cm2(10cm的培養皿指的是培養皿的外徑,而培養皿的內徑約為8.4cm,故根據內徑可求出其底面積為55cm2),所以實際傳代比例為1:2.2。

        4、 在有關離心機的實驗中,標準的離心條件應該是用RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量,而在實際大家實驗過程中,往往習慣用rmp即每分鐘轉速來表示;RCF即表示相對離心場,以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數來表示;RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r(其中r表示離心機轉軸中心與離心管中心的距離,單位為cm);所以每個實驗室離心機轉速設置是不一樣的,常規建議1200rpm 大約250g。

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